أهمية المعالجة المسبقة للعينة
تعتبر المعالجة المسبقة للعينة خطوة تستغرق وقتًا طويلاً وعرضة للخطأ في التحليل الآلي (خاصة التحليل الكروماتوغرافي). تؤثر جودة معالجة العينة بشكل مباشر على النتيجة النهائية للتحليل الكروماتوغرافي. لذلك، من أجل تحسين كفاءة التحليل والتقدير، يعد تحسين وتحسين أساليب وتقنيات تحضير العينات للتحليل الكروماتوغرافي أمرًا مهمًا. نظرًا لأن بعض العينات تنتمي إلى أنظمة مصفوفة معقدة، تحتوي على مكونات مثل البروتينات والزيوت والكربوهيدرات والأصباغ وما إلى ذلك، فإن خلفية المصفوفة المعقدة ستسبب مشكلة كبيرة في استخلاص وفصل وتنقية وتحديد المركبات المستهدفة المراد تحليلها. ولذلك، فإن المعالجة المسبقة للعينة ليست معقدة وصعبة فحسب، بل لها أيضًا دور حاسم في دقة نتائج التحليل وموثوقيتها وحساسيتها.
النسبة المئوية لاستهلاك وقت المعالجة المسبقة للعينة
بالنسبة لأجهزة LC/MS/MS شديدة الحساسية، تعد المعالجة المسبقة المناسبة للعينة أمرًا بالغ الأهمية لتقليل تداخل المصفوفة وإثراء المكونات.
مبادئ المعالجة المسبقة للعينات
تجنب التغيرات الكيميائية في المكونات أثناء التحضير؛ منع وتجنب تلوث المكونات المحددة مسبقًا؛ التقليل من إدخال المركبات غير ذات الصلة في عملية التحضير؛ وجعلها بسيطة وسهلة قدر الإمكان.
الغرض من المعالجة المسبقة للعينة
إزالة الجزيئات. تقليل الشوائب المتداخلة. تركيز المكونات النزرة. تحسين حساسية الكشف والانتقائية. تحسين تأثير الانفصال. حماية الأعمدة والأدوات الكروماتوغرافية؛ استبدال المذيبات.
اتجاه تطوير المعالجة المسبقة للعينة
◀ تشمل المعالجة المسبقة الشائعة للعينات ما يلي: طريقة الهضم: طريقة وضع العينة مع حمض أو مادة مؤكسدة أو محفز وما إلى ذلك في جهاز ارتجاع أو جهاز مغلق، وتسخين المواد العضوية وتحللها وتدميرها. طريقة الهضم الرطب
1. طريقة هضم حمض النيتريك (لعينات المحاليل المائية الأكثر وضوحا) 2. طريقة هضم حمض النيتريك-حمض البيركلوريك (هضم العينات التي تحتوي على مواد عضوية يصعب أكسدةها) 3. طريقة هضم حمض النيتريك-حمض الكبريتيك (حمض النيتريك: حمض الكبريتيك)=5:2، غالبًا ما يتم إضافة كمية صغيرة من بيروكسيد الهيدروجين) 4. طريقة هضم حمض الكبريتيك وحمض الفوسفوريك (تساعد على القضاء على تداخل أيونات الحديد 3+ أثناء التحديد) 5. طريقة هضم حامض الكبريتيك وبرمنجنات البوتاسيوم (تستخدم عادة لتحديد عينات المحاليل المائية للزئبق) 6. طريقة هضم حامض النيتريك وبيروكسيد الهيدروجين: يستخدم بعض الأشخاص هذه الطريقة لهضم المنتجات البيولوجية تحديد النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم والبورون والزرنيخ والفلور وغيرها من العناصر 7. طريقة الهضم متعدد المكونات: نظام هضم ثلاثي أو أكثر من الأحماض أو الأكسدة مطلوب. طريقة الرماد الجاف (طريقة التحلل بدرجة حرارة عالية)
1. لا تستخدم طريقة الرماد أو تستخدم كمية صغيرة من الكواشف الكيميائية لتحليل العينات، ويمكنها التعامل مع عينات وزن أكبر، لذلك من المفيد تحسين دقة تحديد العناصر النزرة. 2. درجة حرارة الرماد بشكل عام هي 450-550 درجة، وهي غير مناسبة لمعالجة العينات ذات المكونات المتطايرة، كما أن وقت الرماد طويل نسبيًا أيضًا. 3. وفقا لنوع العينة وخصائص المكونات المراد قياسها، يتم اختيار البوتقات ودرجات حرارة الرماد المختلفة. البوتقات شائعة الاستخدام هي الكوارتز والبلاتين والفضة والنيكل والحديد والخزف والبولي تترافلوروإيثيلين وغيرها من الخصائص. المبدأ هو أن البوتقة لا تتفاعل مع العينة وتكون مستقرة عند درجة حرارة المعالجة. 4. عادة، لا تتم إضافة أي كواشف أخرى إلى عينات الرماد البيولوجية، ولكن من أجل تعزيز التحلل ومنع فقدان التطاير لعناصر معينة، غالبًا ما تتم إضافة كمية مناسبة من عامل الرماد المساعد. بعد رماد العينة بالكامل، يتم إذابتها في حمض النيتريك المخفف أو حمض الهيدروكلوريك لتحليلها وتحديدها.
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40μm) أكبر من HLPC (3-10μm). لذلك، لا يمكن استخدام SPE إلا لفصل المركبات ذات خصائص الاحتفاظ المختلفة جدًا. تُستخدم تقنية SPE ذات كفاءة الفصل المنخفضة بشكل أساسي لمعالجة العينات. والغرض من SPE هو إزالة المواد التي تتداخل مع التحليل اللاحق من العينة؛ إثراء المكونات النزرة وتحسين الحساسية التحليلية؛ تغيير عينة المذيب لتتناسب مع الطريقة التحليلية؛ الاشتقاق في الموقع؛ تحلية العينة؛ وتسهيل تخزين ونقل العينات. تركيب عمود SPE: يختلف حجم جسيمات الحشو عن حشو عمود HLPC، والباقي هو نفسه. الأكثر استخدامًا هي المرحلة C18. هذا النوع من الحشو شديد الكارهة للماء ويظهر الاحتفاظ بمعظم المواد العضوية في الطور المائي؛ كما يتم استخدام مواد أخرى ذات خصائص انتقائية واستبقاء مختلفة. يمكن استخدام مراحل SPE مع المجموعات النشطة أو المغلفة بالمركبات النشطة لتحليل تفاعلات الاشتقاق. قرص SPE: يشبه إلى حد كبير المرشحات الغشائية. مستخرج القرص عبارة عن قرص PTFE يحتوي على حشو أو ورقة من الألياف الزجاجية محملة بحشو؛ يمثل الحشو حوالي 60% إلى 90% من إجمالي قرص SPE، ويبلغ سمك القرص حوالي 1 مم. الفرق عن السابق هو نسبة سمك/قطر السرير (L/d). مناسبة لإثراء الملوثات النزرة من الماء. الاستخراج الدقيق للطور الصلب (SPME) غير متصل بالإنترنت وSPE غير متصل SPE 1. يتم إجراء SPE والتحليل بشكل مستقل، ولا يوفر SPE سوى عينات مناسبة للتحليل اللاحق. 2. من أجل ضمان الاتصال الكافي بين محلول العينة والحشو، لا يمكن أن يكون تدفق المذيب مرتفعًا جدًا. 3. يمكن إكماله بواسطة الأدوات الآلية. تتكون أداة SPE الأوتوماتيكية من حامل عمود، ومضخة غطاس، وخزان سائل، وخط أنابيب، ومعالج عينات. تُعرف تقنية SPE عبر الإنترنت أيضًا باسم تقنية التنقية والإثراء عبر الإنترنت، والتي تستخدم بشكل أساسي لإنشاء تحليل HLPC طريقة SPE غرض المعالجة المسبقة للعمود: 1. إزالة الشوائب التي قد تكون موجودة في الحشو؛ 2. قم بإذابة الحشو وتحسين إمكانية تكرار نتائج استخراج الطور الصلب. إضافة العينة 1. لمنع فقدان التحاليل، يجب ألا يكون تركيز مذيب العينة مرتفعًا جدًا؛ 2. عند الاستخراج باستخدام ميكانيكا الطور العكسي، يتم استخدام الماء أو المخزن المؤقت كمذيب، ولا تتجاوز كمية المذيب العضوي 10% (V/V)؛ 3. للتغلب على فقدان التحاليل أثناء إضافة العينة، يمكن استخدام المذيبات الضعيفة لتخفيف العينة، وتقليل حجم العينة، وزيادة كمية الحشو في عمود SPE، واختيار الممتزات التي لديها احتفاظ قوي بالمادة التحليلية. الشطف وجمع التحليلات (حالة أخرى هي الاحتفاظ بالشوائب أثناء مرور التحليلات عبر العمود) (استخلاص الطور الصلب باستخدام وسائط التشتيت الصلبة) 1. بالنسبة لأعمدة استخلاص الطور العكسي، يكون مذيب التنظيف عبارة عن ماء أو محلول عازل يحتوي على تركيز مناسب من المواد العضوية مذيب؛ 2. لتحديد التركيز الأمثل وحجم مذيب التنظيف، أضف العينة إلى عمود SPE، وقم بتنظيفها بحجم 5 إلى 10 أضعاف حجم قاعدة عمود SPE، ثم قم بتجميع وتحليل النفايات السائلة بدورها، واحصل على ملف تعريف الشطف من مذيب التنظيف للتحليل. زيادة قوة مذيب التنظيف بدوره، وتحديد القوة والحجم المناسبين لمذيب التنظيف وفقًا لملف الشطف الخاص بالحليلة عند نقاط قوة مختلفة؛ 3. الغرض من الشطف والجمع: شطف المادة التحليلية بالكامل وتجميعها في أصغر جزء من الحجم، مع الاحتفاظ بأكبر عدد ممكن من الشوائب التي يتم الاحتفاظ بها بقوة أكبر من المادة التحليلية الموجودة في عمود SPE؛ 4. لزيادة تركيز المادة التحليلية أو ضبط خصائص المذيب للتحليل اللاحق، يمكن تجفيف جزء المادة التحليلية المجمعة باستخدام النيتروجين ومن ثم إذابته في كمية صغيرة من المذيب. تطبيق التحليل البيئي SPE 1. تركيز المواد التحليلية في العينات البيئية مثل المياه السطحية منخفض للغاية، ويجب إثراء المادة التحليلية قبل التحليل. 2. تركيبة السوائل البيولوجية معقدة وتحتوي على كمية كبيرة من البروتين. قبل التحليل، يجب معالجة العينة مسبقًا لإزالة البروتين. تحليل الأدوية التحليل السريري تحليل الأطعمة والمشروبات الاستخلاص الدقيق للمرحلة الصلبة (SPME) يدمج الاستخلاص الدقيق للمرحلة الصلبة "أخذ العينات والاستخلاص والتركيز والحقن" ويمكن استخدامه جنبًا إلى جنب مع كروماتوغرافيا الغاز أو كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء لتكنولوجيا المعالجة المسبقة للعينات. نظرية الاستخراج الدقيق للطور الصلب نظرية التوازن: أثناء عملية الامتزاز، يتم إنشاء توازن الامتزاز بين الطور الصلب والسائل أو الغازي. وفي غضون فترة زمنية معينة، وبسبب بطء عملية نقل الكتلة، لا يتم الوصول إلى التوازن بالكامل. تعتمد انتقائية استخراج مواد الطلاء بشكل أساسي على أداء مادة الطلاء. وفقًا للمبدأ القائل بأن الحليلة يمكن استخلاصها بسهولة بواسطة مرحلة صلبة ذات قطبية مماثلة، يتم اختيار طلاء SPE مناسب. المواد الأكثر استخدامًا لطلاءات الطور الصلب هي بولي ميثيل سيلوكسان (PDMS) وبولي أكريلات (PA)، وكلاهما يمكن استخدامهما في كروماتوغرافيا الغاز والكروماتوغرافيا السائلة. يستخدم الأول في الغالب للمركبات غير القطبية مثل المركبات المتطايرة، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات والهيدروكربونات العطرية، ويستخدم الأخير في الغالب للمركبات القطبية مثل التريازينات والمركبات الفينولية. يمكن طلاء طبقة الطور الصلبة على ألياف الكوارتز في شكل غير مرتبط أو مرتبط أو متقاطع جزئيًا. يمكن أن تؤدي إضافة بعض البوليمرات إلى الطلاء إلى زيادة مساحة سطح الطلاء وتحسين كفاءة SPME. 1. بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان- ديفينيل بنزين (PDMS-DVB)، يستخدم في الهيدروكربونات العطرية والمركبات المتطايرة. 2. البولي إيثيلين جلايكول ديفينيل بنزين (CW-DVB)، يستخدم للمركبات القطبية مثل الكحولات. 3. راتينج قالب جلايكول البولي إيثيلين (CW-TPR)، يستخدم للمواد الخافضة للتوتر السطحي المؤينة. 4. ألياف الكوارتز المطلية بأسود الكربون الجرافيت، تستخدم لتحليل الملوثات النزرة في الماء والهواء. 5. إنشاء طرق الأنابيب النانوية الكربونية والأنابيب النانوية ثاني أكسيد التيتانيوم 1. الحفاظ على اتساق شروط أخذ العينات. 2. تشمل العوامل التي تؤثر على أخذ العينات وقت أخذ العينات، ودرجة الحرارة، وعمق الألياف، وما إلى ذلك. 3. الحفاظ على علاقة خطية بين قيمة الاستجابة والتركيز الأولي للمادة التحليلية. لا يمكن أن يكون تركيز العينة مرتفعًا جدًا ولا يمكن أن يكون حجم العينة صغيرًا جدًا، بحيث يكون الاستخراج ضمن النطاق الخطي لأيسوثرم الامتزاز. 4. يمكن أن تؤدي إضافة الشوارد إلى العينة إلى زيادة القوة الأيونية للمحلول، وبالتالي تقليل قابلية ذوبان الحليلة وتحسين كفاءة الاستخلاص؛ إن تغيير الرقم الهيدروجيني للعينة له تأثير أكبر على معدل استخلاص المواد الحمضية والقلوية. ملاحظة: تأثير إضافة الملح في الاستخراج الدقيق يختلف في بعض الأحيان عن تأثير استخلاص السائل السائل التقليدي، ويجب تحسين الظروف التجريبية. 5. التحريك يمكن أن يقلل من وقت الاستخراج. الاستخلاص بالميكروويف (MAE) يتميز الاستخلاص بالميكروويف بوقت استخلاص قصير، وانتقائية جيدة، ومعدل استرداد مرتفع، واستخدام منخفض للكاشف، وتلوث منخفض، ويمكن استخدام الماء كمستخلص، ويمكنه التحكم تلقائيًا في ظروف تحضير العينة؛ له تطبيقات أقل ويستخدم حاليًا في استخلاص الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات وبقايا المبيدات الحشرية والمركبات المعدنية العضوية والمكونات النشطة في النباتات والمواد الضارة والمعادن في المعادن والأدوية في الدم وبقايا المبيدات في العينات البيولوجية. مبادئ وخصائص طرق الاستخلاص بالموجات الدقيقة امتصاص الموجات الدقيقة (الماء والإيثانول والأحماض والقلويات والأملاح) كفاءة عالية في الاستخلاص بالموجات الدقيقة: 1. التأثير المباشر لأفران الميكروويف على المواد المنفصلة. 2. من المفيد استخدام المذيبات القطبية أكثر من المذيبات غير القطبية لاستخراج الموجات الدقيقة. 3. استخدام الحاويات المغلقة يسمح بإجراء الاستخلاص بالموجات الدقيقة عند درجة حرارة أعلى بكثير من نقطة غليان المذيب، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة الاستخلاص بالميكروويف يعكس الموجات الدقيقة (المواد المعدنية) ينقل الموجات الدقيقة (المواد غير القطبية) الاستخلاص بالميكروويف المعدات والطرق (المكونات الرئيسية عبارة عن أجهزة تسخين بالموجات الدقيقة وحاويات الاستخراج وأجهزة التحكم في الضغط ودرجة الحرارة مجهزة وفقًا لمتطلبات مختلفة) متعددة التجاويف 2450 ميجا هرتز: يمكن تحضير عينات متعددة في وقت واحد، ومن السهل التحكم في الاستخراج الظروف، والاستخراج سريع. طريقة الاستخلاص التقليدية بالميكروويف: قم بخلط المذيبات القطبية أو خليط من المذيبات القطبية والمذيبات غير القطبية مع العينات المستخرجة، ووضعها في حاويات تحضير عينات الميكروويف، وتسخينها في نظام تحضير عينة الميكروويف تحت حالة مغلقة. التحكم في ضغط الاستخلاص أو درجة الحرارة والوقت حسب متطلبات المكونات المستخرجة؛ في نهاية التسخين، قم بتصفية العينة، ويتم قياس الترشيح مباشرة، أو قياسه بعد المعالجة المقابلة. في ظل الظروف العادية، يكون وقت تسخين الاستخلاص بالميكروويف حوالي 5 إلى 10 دقائق. يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي لمذيب الاستخلاص والعينة 1/3 من حجم كوب تحضير العينة. تركيز أحادي الوضع 2450 ميجاهرتز: لا يلزم التحكم في الضغط ودرجة الحرارة، وحجم تحضير العينة كبير، ويمكن تحضير عينة واحدة فقط في كل مرة، ووقت الاستخراج طويل. استخراج السوائل فوق الحرجة (SCF)
السائل فوق الحرج (SCF) هو سائل تكون درجة حرارته وضغطه أعلى من النقطة الحرجة. خصائصه الخاصة هي: 1. معامل انتشاره أصغر من معامل انتشار الغاز، ولكنه أعلى بدرجة واحدة من معامل انتشار السائل؛ 2. لزوجته قريبة من لزوجة الغاز. 3. كثافته مماثلة لكثافة السائل، والتغير الطفيف في الضغط يمكن أن يؤدي إلى تغير كبير في كثافته؛ 4. التغيرات في الضغط أو درجة الحرارة يمكن أن تؤدي إلى تغيرات في الطور. المبدأ الأساسي في الحالة فوق الحرجة، يتم ملامسة السائل فوق الحرج مع المادة المراد فصلها، بحيث يمكنه استخلاص مكونات القطبية ونقطة الغليان والكتلة الجزيئية النسبية بدورها بشكل انتقائي، وتزداد الكثافة وثابت العزل الكهربائي للسائل فوق الحرج مع زيادة ضغط النظام المغلق، وتزداد القطبية. يمكن استخراج مكونات الأقطاب المختلفة خطوة بخطوة باستخدام برنامج Boost. قابلية ذوبان ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج: 1. يمكن استخلاص المكونات المحبة للدهون ومنخفضة الغليان عند ضغط منخفض (104 كيلو باسكال)؛ 2. كلما زاد عدد المجموعات القطبية للمركب، زادت صعوبة استخلاصه؛ 3. كلما زادت الكتلة الجزيئية النسبية للمركب، زادت صعوبة استخلاصه. المعدل CO2 هو مذيب غير قطبي، وبشكل عام يتم إضافة مذيب قطبي لتحسين قابليته للذوبان في ثاني أكسيد الكربون، لذلك يطلق عليه المعدل. وأكثرها استخدامًا هي الميثانول، والأسيتون، والإيثانول، وخلات الإيثيل، وما إلى ذلك. ويكون تأثير المُعدِّل محدودًا. أثناء تغيير قابلية ذوبان السائل فوق الحرج، فإنه سيضعف أيضًا تأثير الالتقاط لنظام الاستخلاص، مما يؤدي إلى زيادة المستخلصات المشتركة، والتي قد تتداخل مع التحديد التحليلي. يجب أن تكون كمية المعدل المستخدمة صغيرة، ولا تتجاوز عمومًا 5%. إن تطبيق تكنولوجيا استخلاص السوائل فوق الحرجة له مزايا كبيرة في استخلاص المواد الطبيعية؛ يمكن استخدامه مع GC، IR، MS، LC، وما إلى ذلك ليصبح طريقة تحليلية فعالة.
